丝状真菌线粒体DNAout

丝状真菌线粒体DNAout

 线粒体是重要的、负责能量产生的极其重要的细胞器。对丝状真菌线粒体进行生化，遗传和分子生物学研究都需要先进行线粒体纯化。本产品就是基于密度梯度离心的，专门用于从丝状真菌叶片中纯化完整线粒体、再从中纯化线粒体DNA的试剂盒。它具有下列特点：
1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。
2. 所得线粒体可用于后续的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析、线粒体DNA和线粒体RNA纯化。
3. 本产品足够15次线粒体纯化和15次线粒体DNA提取，每次可处理10-20g菌丝体，能得到1-5 mg左右线粒体。
4. 已经成功用于Aspergillus candidus、Aspergillus nidulans、Magnaporthe oryzae、Neurospora crassa、Penicillium chrysogenum、Rhizopus stononifer等丝状真菌。
RNA提取法：试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA，有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤：
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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