SSPE溶液,20×

SSPE溶液,20×

SSPE全名是Saline-Sodium Phosphate- EDTA。20×的SSPE含3 M NaCl、0.2 M NaH2PO4、0.02 M Na2EDTA, pH为7.4。它是一种在核酸分子杂交中广泛使用的溶液。其特点是： 

1． 盐浓度接近饱和SSPE溶液,20×，可以非常方便地稀释到不同浓度，提供不同的杂交和洗涤严谨度。

2． 高盐浓度可以抑制微生物生长，便于长期放置。

3． 可以用于几乎所有核酸杂交试验。由于缓冲能力比SSC强，更适合于需要稳定pH的实验。

RNA提取法：试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，SSPE溶液,20×离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA，有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤：
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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