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即用型蓝白T载体A型(T7-SP6,有MCS)

简要描述:

即用型蓝白T载体A型(T7-SP6,有MCS)本产品是用XcmI酶切线性化的DNA片段,其两个末端的5'都有一个突出的T,可以用于快速克隆具有加尾活性的耐热酶(如Taq DNA聚合酶)扩增得到的PCR片段。
1. 由于是通过酶切制备,所以载体两端的带T率为100%,远高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端转移酶在平末端载体加尾得到的T载体。
2. 克隆的阳性率一般在90%以上,缩短了筛选过程。

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即用型蓝白T载体A型(T7-SP6,有MCS)

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即用型蓝白T载体A型(T7-SP6,有MCS)

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本产品是用XcmI酶切线性化的DNA片段,其两个末端的5'都有一个突出的T,可以用于快速克隆具有加尾活性的耐热酶(如Taq DNA聚合酶)扩增得到的PCR片段。

1. 由于是通过酶切制备,所以载体两端的带T率为100%,远高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端转移酶在平末端载体加尾得到的T载体。

2. 克隆的阳性率一般在90%以上,缩短了筛选过程。

3. 插入位点两侧有对称的常见酶的酶切位点(如BstZI、EcoRI、NotI),便于对克隆的PCR片段进行近一步的分析。

4. 克隆位点两侧分别有T7和SP6 RNA聚合酶启动子,便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。

5. 可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。

6. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α 肽编码区内,可以进行蓝白斑筛选。

7. 含有丝状噬菌体f1 复制起始子,可以制备单链DNA。

RNA提取法:试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤:
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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