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菌落PCR试剂盒2.0

简要描述:

菌落PCR试剂盒2.0本产品可用于不经过E.coli培养和质粒提取而直接从转化子中筛选重组子,其原理是直接利用E.coli菌落作为PCR模板,以识别载体质粒或/和插入片段顺序的寡核苷酸为引物对重组子进行筛查,通过PCR产物的有无和片段的大小来判断外源DNA片段是否被成功克隆到载体质粒之中,使用本产品可以使质粒鉴定过程从两天缩短到几小时。

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菌落PCR试剂盒2.0

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菌落PCR试剂盒2.0

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本产品可用于不经过E.coli培养和质粒提取而直接从转化子中筛选重组子,其原理是直接利用E.coli菌落作为PCR模板,以识别载体质粒或/和插入片段顺序的寡核苷酸为引物对重组子进行筛查,通过PCR产物的有无和片段的大小来判断外源DNA片段是否被成功克隆到载体质粒之中,使用本产品可以使质粒鉴定过程从两天缩短到几小时。

1. 简单快速,用户只需要提供PCR引物和E.coli菌落,不需要细菌培养和质粒提取,整个筛选过程从一天缩短到2-3小时,节约时间和成本。本产品与常用E.coli菌株和载体兼容。既可小规模筛选,也适用于大规模筛查。

2. 高灵敏度,既可用于高拷贝质粒,也适合于低拷贝质粒。

3. 高特异性,本产品采用了十分有效的办法控制了培养基上残留质粒对PCR的影响,使假阳性率低于5%,而绝大部分同类产品的十分容易出现假阳性。

4. PCR反应体系中含有惰性电泳染料,反映完成后可直接上样电泳,不需另加上样液。

5. 处理过的菌落样品低温长期保存后仍能用于PCR筛查。

6. 性价比高,价格更质粒提取试剂相当,但节约一天时间。


RNA提取法:试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤:
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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