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KM 71酵母菌

简要描述:

KM 71酵母菌KM71是毕赤酵母菌株,属于真核细胞。具有氨苄和卡纳抗性。质粒转化的条件为电转化,应用于蛋白表达。适宜生长温度是28至30度,一般可以设置在30度培养,温度超过32度对蛋白的表达是有害的,并可能导致细胞的死亡。本菌株是组氨酸缺陷型(His4基因型),如果表达载体上携带有组氨酸基因,可补偿宿主菌的组氨酸缺陷,因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的

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KM 71酵母菌

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KM71是毕赤酵母菌株,属于真核细胞。具有氨苄和卡纳抗性。质粒转化的条件为电转化,应用于蛋白表达。适宜生长温度是28至30度,一般可以设置在30度培养,温度超过32度对蛋白的表达是有害的,并可能导致细胞的死亡。本菌株是组氨酸缺陷型(His4基因型),如果表达载体上携带有组氨酸基因,可补偿宿主菌的组氨酸缺陷,因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。KM71毕赤酵母可以在YPD培养基中生长,或者在补充有组氨酸的minimal media中生长,但是无法在单独的minimal media培养基中生长。
RNA提取法:试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤:
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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