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考马斯亮蓝G-250

简要描述:

考马斯亮蓝G-250与蛋白质产生明显的有颜色的复合物。可在胶内测定仅有0.5微克/平方厘米的蛋白。在酸性染色介质中形成的考马斯亮蓝的阴离子通过静电作用结合蛋白质子化了的氨基基团;在合适的条件下所产生的复合物是可逆的。当溶解在pH为3.0的0.01M柠檬酸缓冲液中时,最大吸收峰为555纳米;只有染料时最大吸收峰为549纳米,蛋白-染料复合物的峰会比单纯染料的峰略宽。

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考马斯亮蓝G-250

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考马斯亮蓝G-250

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与蛋白质产生明显的有颜色的复合物。可在胶内测定仅有0.5微克/平方厘米的蛋白。在酸性染色介质中形成的考马斯亮蓝的阴离子通过静电作用结合蛋白质子化了的氨基基团;在合适的条件下所产生的复合物是可逆的。当溶解在pH为3.0的0.01M柠檬酸缓冲液中时,最大吸收峰为555纳米;只有染料时最大吸收峰为549纳米,蛋白-染料复合物的峰会比单纯染料的峰略宽。
RNA提取法:试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤:
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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