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双荧光素酶报告基因检测试剂盒

简要描述:

双荧光素酶报告基因检测试剂盒 由于检测光量子的方法非常敏感,采用生物发光(bioluminescent)法 ,是报告基因检测较常用的有效手段。荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素(luciferin)的转化,发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应,具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8

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双荧光素酶报告基因检测试剂盒

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 由于检测光量子的方法非常敏感,采用生物发光(bioluminescent)法 ,是报告基因检测最常用的有效手段。荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素(luciferin)的转化,发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应,具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围),酶的检测灵敏度达10-18~10-20 mol,但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。利用这一特性,将这两种荧光素酶配合,即可形成十分有效的双荧光素酶报告基因系统,其中Ranilla luciferase通常作为内参照。本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。采用通用裂解缓冲液,适合于两种荧光素酶活性的保持,且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容。优化的两种酶反应体系,使每种发光反应持续数十分钟,以便于手工操作多个样品,并保证Firefly luciferase发光及时淬灭,不影响后续Ranilla luciferase的测定。优化的反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围,更有利于后续数据的比较。该产品特点如下:
1. 准确性高:使用海肾荧光素酶作为内参照,减少了细胞数目、细胞健康状态、转染效率和非特异性细胞反应等因素的影响,使主报告基因的结果归一化
2. 高度灵敏:对两种荧光素酶的检测灵敏度达10-18~10-20 mol
3. 线性范围宽:线性范围达到7~8个数量级
4. 快速简便:一体化两步法检测,特别适合于高通量筛选
RNA提取法:试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤:
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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