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基因结构和功能研究产品

简要描述:

基因结构和功能研究产品基因的定点突变是重要的分子生物学技术,广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA模板,而得到单链DNA模板又需要先将基因克隆到类似M13这种载体中,操作过程冗长。为了克服这些缺点,本公司将突变位点设计到一对互补的引物中,用高保真DNA聚合酶扩增质粒模板,然后用Dpn I去除原始的甲基化模板,新合成的DNA通过互补形成带切口的双链质粒,直接

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基因的定点突变是重要的分子生物学技术,广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA模板,而得到单链DNA模板又需要先将基因克隆到类似M13这种载体中,操作过程冗长。为了克服这些缺点,本公司将突变位点设计到一对互补的引物中,用高保真DNA聚合酶扩增质粒模板,然后用Dpn I去除原始的甲基化模板,新合成的DNA通过互补形成带切口的双链质粒,直接用于转化感受态细菌。本产品具有下列特点:
1. 直接使用质粒DNA作为模板,免去了制备单链DNA的步骤。
2. 基于高保真PCR,对模板DNA序列没特殊要求,可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。
3. 一管式,全部在一个优化的缓冲体系中完成,非常简单。
4. 使用Dpn I去除未突变模板,突变效率高达90%。
5. 不需要连接步骤,反应结束后可以直接转化。
6. 提供阳性对照质粒pUC19和突变引物,便于分析失败原因。
7. 可用于制备点突变,缺失突变和插入突变。
8. 使用于从dam+细菌中纯化的质粒(常用的宿主菌都是dam+),由于JM110和SCS110为dam-,所以从中提取的质粒不能用本产品制备突变。
RNA提取法:试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤:
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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