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多点突变试剂盒

简要描述:

多点突变试剂盒本试剂盒是利用一对设计特殊的锚定引物(Anchor Primer)及几条定点突变引物对DNA多个不同位点同时进行定点突变的试剂盒。锚定引物“尾巴"上的特异性序列是与大多数基因都不相匹配的,因此保证了PCR扩增的特异性。本试剂盒的主要原理是:设计合成同一方向的锚定引物及定点突变引物,将锚定引物及定点突变引物用T4聚核苷酸激酶磷酸化后与模板质粒DNA进行退火,再使用T4 DNA聚合酶和T

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多点突变试剂盒

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本试剂盒是利用一对设计特殊的锚定引物(Anchor Primer)及几条定点突变引物对DNA多个不同位点同时进行定点突变的试剂盒。锚定引物“尾巴”上的特异性序列是与大多数基因都不相匹配的,因此保证了PCR扩增的特异性。本试剂盒的主要原理是:设计合成同一方向的锚定引物及定点突变引物,将锚定引物及定点突变引物用T4聚核苷酸激酶磷酸化后与模板质粒DNA进行退火,再使用T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶进行延伸和连接形成突变单链,然后使用锚定引物“尾巴”上的特异性引物(ETail F/ETail R)和高保真DNA聚合酶对突变单链进行PCR扩增,再将获得的双链PCR产物克隆回原载体中,即可达到实验目的,获得目的突变体。本试剂盒操作快速简单,只需一天时间便可以完成整个突变操作。本试剂盒尤其适用于插入片段长度在1.0 kb以下的多位点基因突变实验,对于1.0 kb以上的DN段的多位点基因突变,由于引物退火的不完全、PCR扩增中可能引入新的突变点等原因,可能降低实验成功率。本公司曾经使用本试剂盒,成功进行了1.5 kb DN段的多位点基因突变实验。本试剂盒中的Anchor F1和Anchor R1引物可供克隆于pUC系列载体或pBluescript系列载体中的DN段的多位点基因突变实验,使用方便。使用试剂盒中的Control质粒及各种Control实验用引物可进行Control实验。
RNA提取法:试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤:
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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