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Tth DNA聚合酶

简要描述:

Tth DNA聚合酶本酶来源于嗜热菌Thermus thermophilus HB8。在有Mg2+等二价阳离子存在的情况下,具有DNA多聚酶活性。它与Taq酶一样被广泛用于PCR反应,但耐热性比Taq酶高,因此对高GC含量模板的PCR也有较好的效果。本酶基本上没有3'→5'外切酶活性及5'→3'外切酶活性,所以也可用于双脱氧法测序。另外,本酶具有RTase 活性,在Mn2+存在的情况下,RTase

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Tth DNA聚合酶

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Tth DNA聚合酶

250U

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本酶来源于嗜热菌Thermus thermophilus HB8。在有Mg2+等二价阳离子存在的情况下,具有DNA多聚酶活性。它与Taq酶一样被广泛用于PCR反应,但耐热性比Taq酶高,因此对高GC含量模板的PCR也有较好的效果。本酶基本上没有3'→5'外切酶活性及5'→3'外切酶活性,所以也可用于双脱氧法测序。另外,本酶具有RTase 活性,在Mn2+存在的情况下,RTase活性会得到强化。利用该特性,可以用来在同一管中进行逆转录反应和PCR反应,即一步法RT PCR。(但是,在Mn2+存在时,RT-PCR的准确性不高)此外,本酶与Taq DNA多聚酶一样,PCR产物可通过T载体进行TA克隆。它具有下列特点:
1. RT-PCR反应的特异性增加:在较高的温度下进行逆转录,增加了引物杂交和延伸的特异性。
2. 二级结构减少:在较高的温度下进行逆转录,减少了由于RNA二级结构引起的问题。
RNA提取法:试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相, 离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤:
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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